Seu pai, Whihelm Dinesen, era um militar, e cometeu suicídio quando Karen tinha apenas dois anos de idade, atormentado por não conseguir resistir à pressão de sofrer de sífilis, enfermidade que naquela época estigmatizava. Sua mãe, Ingeborg Westenholz, ficou sozinha om cinco filhos para criar, e pode-os manter graças à ajuda de familiares. Karen, como suas irmãs, estudou em prestigiadas escolas suíças.
Em 1914, Karen se casou com um primo afastado, o barão sueco Bror von Blixen-Finecke, e foram viver no Quénia, onde iniciaram uma plantação de café. Porém, Bror era um mulherengo e passava longos períodos afastado de casa, em safáris e campanhas militares. Entre 1915 e 1916, Karen contraiu sífilis, provavelmente de Bror, embora alguns estudiosos acreditem que ela tenha herdado a doença de seu pai. Os Blixens se separaram em 1921 e se divorciaram em 1925.
Em Nairobi, Karen Blixen conheceu e apaixonou-se por Denys Finch Hatton, um piloto do exército britânico e caçador. Viveram juntos de 1926 a 1931. Mantiveram uma relação amorosa intensa, porém cheia de altos e baixos. Engravidou duas vezes, mas perdeu os bebés, provavelmente em consequência da saúde frágil. A relação terminou com a morte de Finch Hatton, num acidente de avião, em 1931. Ao mesmo tempo, o fracasso da plantação de café forçou-a a abandonar suas terras e retornar à Dinamarca.
Antes do retorno à Dinamarca, Karen escreveu A vingança da verdade, publicado em 1926. Após o retorno, seu primeiro livro foi Sete contos góticos, publicado em 1934 sob o pseudónimo de Isak Dinesen; o terceiro livro, o mais conhecido mundialmente, foi Den afrikanske Farm (A fazenda africana), publicado em 1937 e baseado no período em que ela viveu no continente africano. O sucesso alcançado com esta obra firmou sua reputação como escritora, tendo sido premiada com o Tagea Brandt Rejselegat em 1939. Em 1985, o livro foi adaptado para o filme, com o nome de Out of Africa, África Minha em português, sob a direção de Sydney Pollack e com Meryl Streep, Robert Redford e Klaus Maria Brandauer nos papéis principais.
Durante a segunda guerra mundial, Karen escreveu Contos de inverno, publicado em 1942, e o romance As vingadoras angélicas, sob o pseudónimo de Pierre Andrezel, e publicado em 1944. Escreveu também Anedotas do destino, de 1958, que inclui o conto A festa de Babette, também transformado em filme em 1987, e Sombras na pradaria, de 1960, entre outros.
A partir de 1950, a saúde de Karen Blixen se deteriorou, sendo que em 1955 ela teve um terço do estômago retirado devido a uma úlcera. Impossibilitada de se alimentar normalmente, morreu aos 77 anos de idade nas propriedades da família em sua cidade natal e, aparentemente, de má nutrição, pesando apenas 35 quilos.
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