Afonso morreu de uma queda de cavalo durante um passeio, em Alfange, Santarém, à beira do Tejo. Segundo Bernardo Rodrigues, em os Anais de Arzila, o seu aio era João de Meneses, conde de Cantanhede, e esse acontecimento terá ocasionado nesta personagem um grande traumatismo:
À terça feira Dom João de Meneses não avia de cometer cousa alguma polo que lhe aconteceo na morte do príncipe Dom Afonso, como é notorio e sabido a todos os deste reino. Dizem que estando no Algarve, em um lugar seu que se chama Aljazur, em uma terça feira, lhe dérão cartas d'el-rei Dom João o segundo e do príncipe Dom Afonso seu filho, que fose à corte, e se fez prestes e partio a outra terça feira, e tardando oito dias no caminho chegou a Santarem, donde el-rei e o príncipe estavão, outra terça feira, e dahi a oito dias, outra terça feira, correndo a carreira em Alfange, levando o príncipe pela mão, caio do cavalo, da qual queda logo morreo. Deste tão desestrado caso lhe ficou tão grand odio e agouro que nunca a terça feira cometeo cousa alguma, posto que depois foi capitão d'Arzila e d'Azamor e se lhe oferecêrão casos suficientes; e dizia Dom João que em tal dia se pudesse escusar abrir as portas o faria.
Depois da morte de D. Afonso, D. João II nomeou como sucessor o Duque de Beja, seu primo e cunhado, que viria a governar como D. Manuel I e que casou depois com Isabel, a viúva do infante Afonso.