Exerceu o cargo de professor de química em Dijon e depois em Estrasburgo. Casou-se com Marienne Laurente, filha do reitor da Academia. Em 1854 foi nomeado decano da Faculdade de Ciências na Universidade de Lille.
A pedido dos vinicultores e cervejeiros da região, começou a investigar a razão pela qual azedavam os vinhos e a cerveja. De novo, utilizando o microscópio, conseguiu identificar a bactéria responsável pelo processo. Propôs eliminar o problema aquecendo a bebida lentamente até alcançar 48° C, matando, deste modo, as bactérias, e encerrando o líquido posteriormente em cubas hermeticamente seladas para evitar uma nova contaminação. Este processo originou a atual técnica de pasteurização dos alimentos. Demonstrou, desta forma, que todo processo de fermentação e decomposição orgânica ocorre devido à ação de organismos vivos.
Na Inglaterra, em 1865, o cirurgião Joseph Lister aplicou os conhecimentos de Pasteur para eliminar os micro-organismos vivos em feridas e incisões cirúrgicas. Em 1871, o próprio Pasteur obrigou os médicos dos hospitais militares a ferver os instrumentos cirúrgicos e os pensos que seriam utilizados nos procedimentos médicos.
Expôs a "teoria germinal das enfermidades infecciosas", segundo a qual toda enfermidade infecciosa tem sua causa (etiologia) num micróbio com capacidade de propagar-se entre as pessoas. Deve-se buscar o micróbio responsável por cada enfermidade para se determinar um modo de combatê-lo.
Pasteur passou a investigar os microscópicos agentes patogénicos, terminando por descobrir vacinas, em especial a anti-rábica. Fundou em 1888 o Instituto Pasteur, um dos mais famosos centros de pesquisa da atualidade.
Pasteur foi quem derrubou definitivamente a ideia da abiogénese, com a utilização material em vidro chamado pescoço de cisne. Pasteur colocou um caldo nutritivo em um balão de vidro, de pescoço curvo. Ferveu o caldo existente no balão, o suficiente para matar todos os possíveis microrganismos que poderiam existir nele. Cessado o aquecimento, vapores da água proveniente do caldo condensaram-se no pescoço do balão e se depositaram, sob forma líquida, na sua curvatura inferior.
Como os frascos ficavam abertos, não se podia falar da impossibilidade da entrada do "princípio ativo" do ar. Com a curvatura do gargalo, os micro-organismos do ar ficavam retidos na superfície interna húmida e não alcançavam o caldo nutritivo. Quando Pasteur quebrou o pescoço do balão, permitindo o contacto do caldo existente dentro dele com o ar, constatou que o caldo se contaminou com microrganismos provenientes do ar.
Morreu em Villeneuve-L'Etang, no dia 28 de setembro de 1895. Encontra-se sepultado no Instituto Pasteur, em Paris.