Maria de Aragão e Castela faleceu em 1517, com apenas 35 anos, de causas naturais. Foi sepultada no Convento da Madre de Deus, donde foi trasladada para o mosteiro de Belém.
- João III de Portugal, Rei de Portugal (1502 - 1557);
- Isabel de Portugal, esposa do rei espanhol e imperador romano-germânico Carlos V (mãe de Filipe I de Portugal);
- Beatriz de Portugal, Duquesa de Saboia (Lisboa, 31 de dezembro de 1504 - Nice, 8 de janeiro de 1538), casada com Carlos III, Duque de Saboia;
- Luís de Portugal, Duque de Beja, (1506 - 1555), pai de António de Portugal, Prior do Crato;
- Fernando, Duque da Guarda e Senhor de Trancoso (Abrantes, 5 de junho de 1507 - Abrantes, 7 de novembro de 1534), casado com Guiomar Coutinho, Condessa de Marialva;
- Afonso, Cardeal do Reino (Évora, 23 de abril de 1509 - Lisboa, 21 de abril de 1540). Sepultado na Sé de Lisboa, foi trasladado para o Mosteiro dos Jerónimos;
- Maria de Portugal (1511 - 1513);
- Henrique, Cardeal e Rei de Portugal como Henrique I (30 de janeiro de 1512 - 30 de janeiro de 1580);
- Duarte, Duque de Guimarães (1515 - 1540), casado com Isabel de Bragança, bisavô do rei D. João IV de Portugal;
- António de Portugal (9 de setembro de 1516 - viveu poucos dias).