Nascido em Gilmer, Texas, no dia 30 de setembro de 1935. Viveu boa parte da sua infância em São Francisco, Califórnia. Mathis começou a cantar publicamente na escola e em eventos da igreja, o pai rapidamente comprovou o talento do filho e providenciou escolas de canto. O pai de Mathis contratou um professor de canto quando ele tinha aproximadamente treze anos. Ele é um dos poucos cantores populares que receberam ajuda profissional para cantar e a aprendizagem incluiu a ópera. Ele também era um talentoso atleta, ganhou quatro prémios atléticos na escola secundária e uma bolsa de estudos para atletas na Faculdade do Estado em São Francisco. Mathis também permaneceu boa parte da sua vida desportiva em São Francisco. Na própria faculdade ele quebrou o recorde mundial de salto alto do basquetebol (o registo mais alto foi de Bill Russell, saltando 1,96 metros). Na ocasião só quatro atletas Olímpicos tinham conseguido alcançar esta altura. Enquanto treinava para se tornar um professor, ele mostrou o seu talento num concerto e assinou um contrato musical com a Columbia Records.
A decisão mais difícil dele estava entre optar em ir aos Jogos Olímpicos, para os quais ele tinha sido convidado, ou manter o compromisso para fazer as primeiras gravações, que foram definidas em 1956. Embora Mathis tenha optado pela carreira artística, ele nunca perdeu completamente o entusiasmo pelo desporto - é um golfista ávido que foi anfitrião de vários torneios em seu nome nos EUA e no Reino Unido.
Embora frequentemente se descreva como um cantor romântico, a sua discografia inclui um vasto número de estilos: jazz, pop tradicional, brasileiro e música espanhola, soul/R&B, soft rock, e Broadway/Tin e outros padrões. Ele desfrutou um pouco de visibilidade no cinema cedo, quando cantou um dos seus primeiros sucessos, "It's not for me to say", no filme Lizzie, no qual também teve um papel suplente pequeno. Também é mundialmente conhecido por "A Time For Us", tema do filme "Romeu e Julieta" de Franco Zeffirelli, uma das mais conhecidas, clássica e famosa adaptação para o cinema da obra literária de William Shakespeare, em 1968. Mathis também permanece altamente sinónimo da música natalícia, depois de ter gravado seis álbuns de Natal. Ao todo, foram mais de 130 álbuns gravados e vendido mais de 200 milhões de cópias em todo o mundo. Ele tem a distinção de ter a permanência mais longa de qualquer artista de gravação no selo da Columbia Records, depois de ter estado com o rótulo de 1956 a 1963 e de 1968 até o presente. Ele é um dos poucos cantores cuja carreira atravessou seis décadas.
Algumas das canções de grande sucesso incluem "Evie", "My love for you", "Maria" (trilha sonora de West Side Story), "Chances are", "It´s not for me to say", "Wonderful! Wonderful!", "The twelfth of never", "Wild is the wind", "Mundo Divino", "Misty", "Pequeno", "A certain smile", "Gina", "What will my Mary say", "On a clear day (You can see forever)", "Eu estou na Casa ao Lado", "When a child is born", "Gone, Gone, Gone", "Too much, too little, too late" (com Deniece Williams), "Last time I felt like this" (com Jane Olivor), e "Friends in love" (com Dionne Warwick).
Mathis teve muito mais sucesso como um artista de álbuns. Os álbuns dele alcançaram sucesso em parte devido à reputação dele como um excelente acompanhamento para momentos românticos. Alguns dos álbuns célebres dele incluem "Heavenly", "A time for us", "Faithfully", "Open Fire, Two Guitars", "Warm", "Swing Softly", "Johnny's Mood", e "I'll Buy You a Star".
Mathis continua apresentando-se e gravando regularmente. Seu mais recente álbum é "Let It Be Me - Johnny in Nashville", lançado em 2010.
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