Leonor quase foi casada pelo irmão imperador com Carlos III Duque de Bourbon e condestável de França, mas depois da vitória de Pavia, Carlos V decidiu que casaria com próprio rei Francisco I de Valois, viúvo de Cláudia de França, filha de Luís XII. Foi determinado por cláusula do Tratado de Madrid e de Cambrai. O contrato de Cambrai, ou Paz das Damas, estipulava o casamento de D. Leonor com Francisco I, que foi celebrado a 4 de julho de 1530 na abadia de Capsieux em Baiona. O casamento foi contratado em decorrência do ajuste de pazes entre Francisco I e Carlos V, quando o rei francês estava preso em Espanha após a batalha de Pavia. A infanta viveu a partir de então numa corte voluptuosa, esforçando-se por esquecer na oração e nas obras pias as infidelidades do marido. A sua coroação realizou-se solenemente na Basílica de Saint-Denis em 5 de março de 1531. Acabada a coroação, foram para Paris os cônjuges. Era um casamento unicamente político, para tentar sanar a inimizade tradicional entre os Valois e os Habsburgos.
Consta ter vivido desgostosa e quase em isolamento; Francisco I entregava-se às suas amantes, Leonor encerrava-se nos seus aposentos, dedicada às suas orações e à leitura da Bíblia. Finalmente, enviuvou em março de 1547 e sem posteridade alguma, pode retirar-se para Flandres, onde estava o seu irmão.